Question

【題目】乙烯具有促進果實成熟的作用，ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄細(xì)胞合成乙烯的兩個關(guān)鍵酶。利用反義DNA技術(shù)（原理如圖1），可以抑制這兩個基因的表達，從而使番茄具有耐儲存、宜運輸?shù)膬?yōu)點。圖2為融合ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因的反義表達載體的結(jié)構(gòu)示意圖。

（1）圖2中的2A11為特異性啟動子，則2A11應(yīng)在番茄的 ____________（器官）中表達。

（2）從番茄成熟果實中提取 ___________為模板，利用反轉(zhuǎn)錄法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，以進行拼接構(gòu)成融合基因并擴增。

（3）合成出的ACC氧化酶基因兩端分別含限制酶BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位點，ACC合成酶基因兩端含SacⅠ和XbaⅠ的酶切位點，用限制酶____________對上述兩個基因進行酶切，再串聯(lián)成融合基因，相應(yīng)的Ti質(zhì)粒應(yīng)用限制酶 _______________進行切割，確保融合基因能夠插入載體中。

（4）為了實現(xiàn)圖1中反義基因的效果，應(yīng)將融合基因 _______（正向/反向）插入在啟動子 2A11 的下游即可構(gòu)成反義融合基因。將表達載體與農(nóng)桿菌菌液混合后，接種在含有___的培養(yǎng)基中，可篩選出含有反義融合基因的農(nóng)桿菌，再利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因番茄。

（5）在檢測番茄細(xì)胞中是否存在反義融合基因時，____________（填“能”/“不能”）用放射性物質(zhì)標(biāo)記的ACC氧化（合成）酶基因片段做探針進行檢測，理由是____________。

Answer 1

【答案】果實 RNA Xbal BamHl和Sacl 反向 卡那霉素 不能 番茄細(xì)胞內(nèi)本來存在ACC合成酶基因，能與ACC合成酶基因探針發(fā)生分子雜交

【解析】

分析題意和題圖：番茄細(xì)胞中原有靶基因控制合成的ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄細(xì)胞合成乙烯的兩個關(guān)鍵酶。圖1所示為反義基因轉(zhuǎn)錄成的RNA可與靶基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA形成RNA雙鏈，使靶mRNA不能與核糖體結(jié)合或被RNA酶降解，從而阻止了ACC氧化酶和ACC合成酶的合成，影響細(xì)胞中乙烯的合成，使番茄具有耐儲存、宜運輸?shù)膬?yōu)點。圖2所示的基因表達載體的組成包括復(fù)制原點、啟動子、終止子、標(biāo)記基因和目的基因，目的基因插入點在啟動子和終止子之間。

（1）乙烯具有促進果實成熟的作用，因此圖2中的2A11為特異性啟動子，則2A11應(yīng)在番茄的果實中表達。

（2）從番茄成熟果實中提取RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，以進行拼接構(gòu)成融合基因并擴增。

（3）合成出的ACC氧化酶基因兩端分別含限制酶BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位點，ACC合成酶基因兩端含SacⅠ和XbaⅠ的酶切位點，要將兩個基因融合，需用同一種限制酶即XbaⅠ酶對上述兩個基因進行酶切，再用DNA連接酶串聯(lián)成融合基因，這樣融合基因上有三個限制酶切點：BamHⅠ、XbaⅠ、SacⅠ，其中限制酶BamHⅠ、SacⅠ分別位于融合基因的兩端，因此相應(yīng)的Ti質(zhì)粒應(yīng)用限制酶BamHl和Sacl進行切割，確保融合基因能夠插入載體中。

（4）反義融合基因是由番茄果實細(xì)胞中的靶基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的，因此為了實現(xiàn)圖1中反義基因的效果，應(yīng)將融合基因反向插入在啟動子 2A11 的下游即可構(gòu)成反義融合基因。將表達載體與農(nóng)桿菌菌液混合后，接種在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中，可篩選出含有反義融合基因的農(nóng)桿菌，再利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因番茄。

（5）在檢測番茄細(xì)胞中是否存在反義融合基因時，因為番茄細(xì)胞內(nèi)本來存在ACC合成酶基因，能與ACC合成酶基因探針發(fā)生分子雜交，所以不能用放射性物質(zhì)標(biāo)記的ACC氧化（合成）酶基因片段做探針進行檢測。