Question

【題目】（一）圖（a）中的三個 DNA 片段上依次表示出了 EcoRI、BamHI 和 Sau3AI 三種限制性內切酶的識別序列與切割位點，圖（b）為某種表達載體的示意圖（載體上的 EcoRI、Sau3AI 的切點是唯一的）

根據基因工程的有關知識，回答下列問題：

（1）經 BamHI 酶切后得到的目的基因可以與上述表達載體被 _______________酶切后的產物連接。

（2）若某人利用圖（b）所示的表達載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組質粒，如圖（c）所示。這三種重組質粒中，不能在宿主細胞中表達目的基因產物的有_______________。不能表達的原因是___________。

（3） DNA 連接酶是將兩個 DNA 片段連接起來的酶，它作用對象是 ________鍵。

（二）絲素蛋白是家蠶的一種分泌性復合蛋白，由絲素蛋白重鏈（FibH）、絲素蛋白輕鏈（Fibl）和 P25 糖蛋白組成。將 Fibl 基因導入大腸桿菌（不含質粒 A）并實現(xiàn)表達的過程如圖所示。

①構建重組質粒時要用到的工具酶是________________。

②接種在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上的大腸桿菌，有的不能形成菌落，原因是____________。

③影印接種就是用絲絨做成與平板大小相近的印章，然后把長有菌落的母平板倒置在絲絨印章上，輕 輕印一下，再把此印章在新的培養(yǎng)基平板上輕輕印一下。經培養(yǎng)后，比較新平板上長出的菌落與母平板上的菌落位置，推測可能導入了重組質粒的菌落是 ____________（用字母表示）。

④目的基因成功表達的標志是_______________。

Answer 1

【答案】Sau3A I 甲、丙 甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，兩者目的基因均不能轉錄，所以都不能表達目的基因的產物。 磷酸二酯鍵 限制酶和DNA連接酶 沒有導入質粒 b、c 大腸桿菌合成絲素蛋白輕鏈

【解析】

1．基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成．

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等．

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法．

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術．個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

2．基因工程的工具：

（1）限制酶：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂。

（2）DNA連接酶：連接的是兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。

（3）運載體：常用的運載體：質粒、噬菌體的衍生物、動植物病毒。

3.DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補的DNA鏈。

（一）（1） 由于限制酶Sau3A I與BamHI切割后產生的片段具有相同的黏性末端，所以經BamHI酶切割得到的目的基因可以與上述表達載體被Sau3A I酶切后的產物連接。

（2）啟動子是一段有特殊序列的DNA片段，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質。終止子也是一段有特殊結構的DNA短片段，相當于一盞紅色信號燈， 使轉錄在所需要的地方停止下來。在基因表達載體中，啟動子應位于目的基因的首端，終止子應位于目的基因的尾端，這樣目的基因才能表達。而甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，兩者目的基因均不能轉錄，所以都不能表達目的基因的產物。

（3）DNA 連接酶能催化兩個 DNA 片段之間的磷酸二酯鍵形成。

（二）①構建重組質粒需要限制酶和DNA連接酶。

②接種在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上的大腸桿菌，有的不能形成菌落，說明對氨芐青霉素不具有抗性，而導入成功的大腸桿菌都表現(xiàn)出對氨芐青霉素的抗性，故大腸桿菌不能長出菌落的原因是因為沒有導入質粒。

③由圖可知，a、b、c、d都是對氨芐青霉素有抗性的大腸桿菌，說明都是成功導入質粒的大腸桿菌，圖中顯示重組質粒中的四環(huán)素抗性基因被破壞，故導入重組質粒的大腸桿菌不具有對四環(huán)素的抗性，故在含有四環(huán)素培養(yǎng)基上生長的菌落是導入質粒A的大腸桿菌，即圖中的a、d，b、c菌落沒有長出，說明這兩個菌落不具有對四環(huán)素的抗性，故b、c可能是導入重組質粒的大腸桿菌。

④題中的目的基因是Fibl 基因，而目的基因表達成功的含義是控制形成了相應的蛋白質，故本題中目的基因成功表達的標志是大腸桿菌合成絲素蛋白輕鏈。